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                基于倍性的葡萄酒相關酵母釀造特性研究進展
                發布時間:2022-05-08 分享到:
                葡萄酒相關酵母中主導酒精發酵的酵母菌為Saccharomyces(酵母屬)中的Saccharomyces cerevisiae(釀酒酵母),近年來隨著葡萄酒品質的多樣化與特色化,研究者關注non-Saccharomyces(非酵母屬酵母)及非二倍體S. cerevisiae在葡萄酒風味復雜性形成中的作用。本研究對酵母菌不同倍性特征及交配型轉換等基礎理論研究成果進行了綜述,重點分析了酵母菌倍性對發酵性能、耐受性及葡萄酒風味形成的影響,為基于倍性研究篩選葡萄酒釀造性能*的菌株提供理論研究基礎。研究發現,目前主要的倍性研究針對釀酒酵母開展,但相關研究中缺乏對倍性差異影響表型如耐受性等的分子機制研究,此外,如何在發酵中有效利用非二倍體S. cerevisiae和非酵母屬酵母仍依賴于未來針對這些菌株開展的基礎倍性研究。

                摘要葡萄酒相關酵母中主導酒精發酵的酵母菌為Saccharomyces(酵母屬)中的Saccharomyces cerevisiae(釀酒酵母),近年來隨著葡萄酒品質的多樣化與特色化,研究者關注non-Saccharomyces(非酵母屬酵母)及非二倍體S. cerevisiae在葡萄酒風味復雜性形成中的作用本研究對酵母菌不同倍性特征及交配型轉換等基礎理論研究成果進行了綜述,重點分析了酵母菌倍性對發酵性能、耐受性及葡萄酒風味形成的影響,為基于倍性研究篩選葡萄酒釀造性能*的菌株提供理論研究基礎。研究發現,目前主要的倍性研究針對釀酒酵母開展,但相關研究中缺乏對倍性差異影響表型如耐受性等的分子機制研究,此外,如何在發酵中有效利用非二倍體S. cerevisiae和非酵母屬酵母仍依賴于未來針對這些菌株開展的基礎倍性研究。

                關鍵詞:單倍體;二倍體;多倍體;釀酒酵母;非酵母屬

                 

                Research Progress in Wine-making Characteristic of Wine-related Yeast Based on Ploidy

                 

                LIANG Shu-ying, WANG Chun-xiao*

                (Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy, School of Liquor and Food Engineering, Guizhou University, Guiyang Guizhou 550025, China)

                 

                Abstract: Saccharomyces cerevisiae, an important specie from the Saccharomyces genus, is the dominant yeast species for conducting alcoholic fermentation in wine-related yeasts. With the diversification and specialization of wine in recent years, researchers have focused on the role of non-Saccharomyces and non-diploid S. cerevisiae in the complexity formation of wine flavour. This study reviews the basic theoretical research results on different ploidy characteristics and mating type conversion of Saccharomyces cerevisiae, focusing on the effects of Saccharomyces cerevisiae ploidy on fermentation performance, tolerance and wine aroma formation, and providesa theoretical basis for screening strains with excellent winemaking performance based on ploidyresearch. However, the molecular mechanism in S. cerevisiae regulating the phenotypic difference such as tolerance capacity by the ploidy difference are still unclear and need deep research. It is still a question on how to effectively use the non-diploid S. cerevisiae and non-Saccharomycesin fermentation, which still rely on the basic ploidy studies of these yeast strains in the future.

                Key words: haploid; diploid; polyploid; Saccharomyces cerevisiae; non-Saccharomyces


                1 引言

                葡萄酒是在酵母菌等微生物的作用下由葡萄或葡萄汁發酵而成的酒精飲料,研究表明,葡萄表皮、葡萄汁及發酵過程中的葡萄醪包含豐富的野生酵母資源,其中non-Saccharomyces(非酵母屬)酵母主導發酵初期,而Saccharomyces(酵母屬)如Saccharomyces cerevisiae(釀酒酵母)主導發酵中后期[1]。酵母常以單倍體和二倍體兩種營養體存在,由于二倍體比單倍體具有生長優勢,因此葡萄酒釀造中分離的酵母常以二倍體形式存在[2-3]。單倍體酵母常出現在實驗研究中,一方面可用于雜交或原生質體融合育種,為培育發酵特性良好的酵母菌株提供菌種基礎,另一方面對單倍體的某些基因進行敲除、插入或過表達可研究葡萄酒中主要風味物質在酵母菌細胞中的代謝途徑,為二倍體酵母菌通過發酵控制影響葡萄酒風味提供理論支持。本研究對酵母菌不同倍性特征及交配型轉換等基礎理論研究成果進行了綜述,并重點分析了酵母菌倍性研究對發酵性能、耐受性及葡萄酒風味形成的關聯,為基于單倍體研究選育具有優良葡萄酒釀造性能的二倍體菌株提供理論研究基礎。

                2 酵母菌的倍性特征

                目前對酵母菌倍性的認識大都以S. cerevisiae為模式菌種進行研究,S. cerevisiae細胞的單倍體有MATaMATα兩種交配型,分別攜帶aα兩種相反的接合信息[2]。MATαMATa雜交(即攜帶相反結合信息的單倍體之間的結合,也叫異宗配合,圖1A)可產生二倍體MATa/α,在自然界中分離到的S. cerevisiae二倍體大多為MATa/α基因型。此外,S. cerevisiae的二倍體還包含MATa/aMATα/α兩種基因型[4],這兩種基因型在天然條件下的形成概率極低[5],在實驗條件下可通過同宗配合制備這兩種基因型[4]。

                值得注意的是,二倍體MATa/αMATa/a、MATα/α在生長上沒有顯著差異,都可以通過出芽進行繁殖,但它們在細胞形態、產孢和融合能力方面有明顯不同[6]。二倍體MATa/aMATα/α細胞起初為“三葉草”或“腳”形[7],芽殖后產生子代為橢圓形,且不能通過減數分裂產生子囊孢子,或者偶爾會發生,其幾率小于1%[8],而二倍體MATa/α細胞起初為啞鈴形,芽殖后產生橢圓形子代,且具備產孢能力。此外,二倍體MATa/aMATα/α細胞可以通過和相反交配型酵母融合,從而生成更高倍型的酵母細胞[6](圖1B)。HARARI[9]在研究中發現,單倍體S. cerevisiae在無脅迫條件下會自發形成二倍體,但在酒精和高鹽等脅迫條件下二倍體化的頻率大大增加,且二倍體比單倍體更具有環境適應優勢,MATa/α菌株的生長狀況*,菌株MATa/aMATα/α次之,生長*差的是單倍體菌株。在相同的環境下,二倍體比單倍體具有更強的生長優勢,更能適應惡劣的環境并容忍突變[2]。但二倍體的生長優勢也依賴于突變的類型,當有害突變為隱性突變時,二倍體菌株不表達而單倍體菌株表達該有害突變,當有益突變為隱性突變時,二倍體菌株不表達而單倍體菌株表達該有益突變,可以利用單倍體菌株的生長優勢將有益突變的單倍體篩選出來,通過進一步雜交獲得有益突變的二倍體菌株[4,10]。因此,單倍體在有害隱性突變時受影響,而在有益隱性突變時表現優勢[2]。KLEIMAN[11]對芽殖酵母的基因缺失分析結果顯示,單倍體發生有害突變的頻率遠遠超過二倍體,且大部分的有害突變是隱性的。KUTYNA[4]發現親本單倍體菌株的甘油產量均高于他們的純合和雜合二倍體菌株的甘油產量,因此推斷決定S. cerevisiae甘油產量的突變是隱性突變。

                酵母中除了單倍體和二倍體外,還存在著多倍體和非整倍體。多倍體即細胞中含有兩套以上的染色體遺傳物質。非整倍體是指核型與正常染色體組(整倍體)不同,即比整倍體增加或丟失幾條染色體,其中,結構非整倍體是因染色體部分重排而導致染色體結構發生變化[12]。雖然自然界中的酵母都以單倍體或二倍體的形式存在,但也存在著多倍體和非整倍體。ZHU[13]從臨床中分離的S. cerevisiae34%鑒定為三倍體或四倍體,36%為非整倍體; EZOV[14]從以色列卡梅爾山環境中發現了天然存在的三倍體和四倍體S. cerevisiae。

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                A.二倍體S. cerevisiae的形成


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                B.不同二倍體和多倍體S. cerevisiae的生命周期

                1酵母交配型的轉換及不同二倍體和多倍體的產生示意圖[6,12,15]

                Fig.1 Schematic diagram of yeast mating type conversion and production of different diploids and polyploids

                3倍性對葡萄酒相關酵母發酵性能及耐受性的影響研究

                近年來,在食品領域關于不同酵母倍性的研究越來越多,其中葡萄酒相關酵母的倍性研究中以Saccharomyces的研究*廣泛,涉及單倍體、二倍體、多倍體和非整倍體的研究,Brettanomyces的研究次之,包含單倍體、二倍體和多倍體的基礎研究,其余酵母菌僅在單一倍性或某兩種倍性中有研究,如Torula單倍體的研究、Hanseniaspora二倍體的研究、Pichia多倍體的研究及Dekkera多倍體和非整倍體的研究。Saccharomyces的研究以模式菌種S. cerevisiae的倍性研究*多,相關研究包含交配型轉換及鑒定[16-17]、倍性的形成控制[18]、酵母二倍體化的機制[9]、倍性與染色體丟失之間的關系研究[19-20]、非整倍體的形成機制[21-22]、非整倍體的基因組穩定性分析[20]、異宗配合[23]等。non-Saccharomyces的倍性研究以倍性鑒定和細胞生物學基礎研究為主,如D. bruxellensis二倍體轉化為非整倍體[21]等。與發酵特性相關的單倍體制備僅見于non-Saccharomyces中的Torula[24],其他菌種未見報道。

                3.1倍性對葡萄酒相關酵母發酵性能的影響

                倍性對S. cerevisiae發酵性能的影響研究主要包含生孢條件、單倍體制備條件[25]、單倍體的誘變與選育[9]、利用優良單倍體進行雜交育種[26]、多倍體的生長生理特性和發酵特性研究、多倍體與非整倍體倍性的鑒定[27]等,涉及的發酵性能包含乙醇產量、發酵速度、殘糖、甘油等。有相關研究表明,隨著酵母倍性的增加,其生長速度減慢,細胞體積增大,細胞分裂次數增加,芽痕增加[12]。使用親本二倍體和單倍體分別發酵葡萄汁時,發現發酵速度相同,而且隨著發酵的進行,單倍體間會融合形成二倍體。此外,來自不同四分體的單倍體融合率低于來自同一四分體的單倍體融合率,原因是MAT位點與染色體III著絲粒相連而導致雜合性缺失[28]。同一親本的不同單倍體具有不同的CO2失重、產酒精、殘糖、H2S、*醇、酯類等發酵性能,推測是由于多基因控制[17,25,29]。近年來研究者較多關注酵母倍性如何影響葡萄酒發酵及如何利用酵母倍性來提高葡萄酒的風味,但較少研究該影響背后的分子機制。

                此外,非整倍體(3n-1、3n-2、4n-1、4n-2、4n-3)增加了基因組的不穩定性,使多個染色體丟失事件時常發生[20],非整倍體也是導致產孢量少的原因之一,但在工業酵母中,由于含有較高數量的基因拷貝數可以適應不斷變化的發酵環境,因此可以作為非整倍體的優勢特性[22,30]。

                3.2倍性對葡萄酒相關酵母耐受性的影響

                葡萄酒酒精發酵過程涉及不同酵母菌種此消彼長的動態變化,該變化與發酵環境息息相關,如許多環境脅迫因子會通過影響酵母的生存代謝改變*終葡萄酒的品質。葡萄酒酒精發酵過程中的環境脅迫因子包含SO2、乙醇、嗜殺毒素、溫度、鹽及金屬離子等,葡萄酒相關酵母對環境脅迫的耐受能力會影響其生存代謝,因此酵母菌的耐受性研究是葡萄酒風味質量研究的基礎內容之一,具體見表1和圖3。

                1 與葡萄酒相關的酵母菌倍性在耐受性中的應用

                Tab.1 Application of wine-related yeast in tolerance analysis based on ploidy

                耐受性

                種名

                倍性

                倍性與耐受性的關聯

                參考文獻

                SO2能力

                S.cerevisiae

                單倍體

                含有com2調節子的單倍體菌株耐受SO2能力高于其親本單倍體菌株

                [31]

                缺失ADE的單倍體突變體,其亞硫酸鹽的耐受性增強

                [32]

                0~100 mg/L SO2濃度范圍內,單倍體菌株耐SO2能力低于大多數二倍體菌株

                [33]

                B.bruxellensis

                多倍體

                三倍體B.   bruxellensis比二倍體耐受SO2

                [27]

                單倍體至三倍體B.   bruxellensis菌株中,耐SO2能力隨著倍性增加而增加

                [34]

                耐乙醇能力

                S.cerevisiae

                多倍體

                以不同倍性單、二和四倍體S.   cerevisiae為研究對象,發現二倍體的乙醇耐受性*強

                [35]

                S.uvarum

                S. cerevisiae雜交形成的三倍體菌株耐乙醇能力比*二倍體親本差

                [36]

                S.cerevisiae

                非整倍體

                非整倍體的乙醇耐受性會高于整倍體(移出額外的染色體,返回整倍體狀態,其乙醇耐受性大大降低)

                [37]

                與親本二倍體菌株相比,非整倍體的耐乙醇(8%)性降低

                [38]

                嗜殺毒素

                S.cerevisiae

                單倍體

                二倍體產孢后,一半孢子失去嗜殺活性

                [39]

                耐溫度能力

                S.uvarum

                多倍體

                S.   cerevisiae雜交形成三倍體菌株,其耐低溫8℃和高溫39℃)能力高于親本二倍體菌株

                [36]

                S.cerevisiae

                非整倍體

                與親本二倍體菌株相比,非整倍體的耐熱性增加

                [38]

                耐鹽及金屬離子能力

                S.cerevisiae

                非整倍體

                與親本二倍體菌株相比,非整倍體的耐KCl1mol/L、銅離子6.25mmol/L能力均降低

                [38]

                 

                SO2因其抑菌和抗氧化特性在葡萄酒釀造中廣泛應用,但其在發酵過程中的使用會影響酵母菌的活性,因此,發酵主導酵母菌需具備一定的SO2耐受性。相關研究顯示,酵母菌對SO2的耐受性隨倍性增加而增加[27,33-34]。以單倍體菌株為研究對象,分析可能影響SO2耐受性的基因,發現缺失COM2的單倍體無法在含有1.5mmol/L SO2的培養基中生長,而缺失MSN2、MSN4HAA1的單倍體菌株均可生長,說明COM2與酵母菌SO2耐受能力相關[31]。此外,SO2耐受能力還可能與ADE有關[32]。

                乙醇是酒精發酵的主要產物,其含量隨發酵的進行逐漸增加,在葡萄酒酒精發酵結束時其酒精度一般可達10~15% vol,但高濃度乙醇具有抑菌效果,因此,發酵主導酵母菌需具備一定的乙醇耐受性。相關研究表明(表1),非整倍體菌株耐乙醇能力大于整倍體,這一現象與非整倍體菌株中染色體Ⅲ有關[37]。而整倍體菌株中二倍體菌株耐乙醇能力強于其他倍性菌株,研究表明9個基因(ACE2、POL3、PUF4、GFA1、UTH1、JID1、RIM15、ATG11VPS74)與乙醇耐受性有關[35]。此外,倍性會影響細胞的大小,由于SSD1UTH1可增加細胞壁對酶的耐受性,因而細胞壁的穩定性也會增加酵母的乙醇耐受性[40]。酵母菌的嗜殺毒素分泌能力可能與其在酒精發酵過程中的競爭優勢相關,研究發現,嗜殺能力受倍性的影響,決定嗜殺毒素分泌的基因并不存在于所有的單倍體中,一半來自四分體的單倍體會失去嗜殺活性[39]。目前對于耐嗜殺能力尚無倍性相關研究,但該研究與酒精發酵的控制關聯緊密。葡萄酒釀造過程中涉及低溫(10℃左右)或高溫(37℃或65℃)的冷/熱浸漬處理,此外,白葡萄酒的發酵溫度推薦為18~22℃,這些葡萄酒釀造條件對酵母菌的溫度耐受性提出了一定的要求。研究發現,隨著倍性增加,菌株的耐低溫和高溫能力增加,如三倍體菌株的耐低溫(8℃)和耐高溫(39℃)均高于其親本二倍體菌株[36],且非整倍體及其孢子的耐熱性高于親本二倍體及其孢子[38]。

                綜上所述,酵母菌的SO2、乙醇等耐受性與倍性相關,且某些基因可能直接影響酵母菌的耐受性,基于倍性研究開展耐受能力及相關分子機制研究,可為篩選耐受性強的葡萄酒相關酵母提供重要的理論依據。

                3.png

                3 葡萄酒酵母倍性與耐受性及風味物質形成的關聯

                Fig.3 The relation of wine yeast ploidy with tolerance and flavor substances formation

                4 葡萄酒相關酵母倍性研究在葡萄酒風味形成中的應用現狀

                酵母菌在葡萄酒釀造過程中,將葡萄汁中的糖轉化成乙醇、甘油、*醇、醛類和酯類等物質,還通過自溶釋放蛋白質和多糖等細胞成分,這些物質是形成葡萄酒風味的重要物質。S. cerevisiae因具有較強的發酵力和耐受性,是葡萄酒釀造的主導菌種[10]。近年來non-Saccharomyces在葡萄酒風味復雜性研究中受到了關注,Candida、Hanseniaspora、Kloeckera、Metschnikowia、Pichia、Schizosaccharomyces、Torulaspora、Williopsis、Zygosaccharomyces等與S. cerevisiae混合發酵可以降低乙醇和H2S含量,增加酯類、甘油、萜烯類和*醇含量[1,41-43]。研究者仍較多關注S. cerevisiae及其近親種S.uvarum的倍性對葡萄酒風味復雜性的影響,其他酵母菌種的相關倍性研究較少,未來在S. cerevisiae倍性研究基礎上開展non-Saccharomcyes的倍性研究將促進葡萄酒風味的多樣化與復雜性。

                乙醇是葡萄酒的主要成分之一,近年來部分研究聚焦于低醇或無醇葡萄酒的釀造,研究發現可通過酵母菌的倍性變化降低乙醇產量(表2):(1)通過篩選低產乙醇單倍體,并進一步融合成低產乙醇二倍體[25,44],可實現降低乙醇的目標;值得注意的是,WYK[16]融合獲得的二倍體菌株在乙醇產量方面并無顯著差異。(2)通過在單倍體菌株中插入或敲除某些基因來降低乙醇含量。研究表明單倍體菌株中插入pdc2基因會使酒精度降低13%[45],進一步融合為低產乙醇的二倍體后,與二倍體親本菌株相比,總酒精度降低了7.4%;另一研究發現TSA1基因缺失可降低乙醇含量[46]。(3)通過種間雜交形成多倍體從而降低乙醇含量。 LAIRóN-PERIS等通過種間雜交(S. uvarum×S. cerevisiae)獲取了低產乙醇的異源三倍體H14A7,該三倍體中低表達GPX2、AARE1、NDE2ADH2基因[47]。

                甘油是酒精發酵的主要副產物之一,可賦予葡萄酒圓潤的口感,增加復雜性。甘油產量主要受代謝條件和菌株差異影響[43,47],研究發現葡萄酒S. cerevisiae的甘油產率明顯低于其他工業S. cerevisiae[48]。S. bacillaris、C. stellata、Starmerella bombicola(球擬假絲酵母)、H. uvarum、M. pulcherrima、Issatchenkia orientalisL. thermotolerans能增加甘油產量[43,49],C. sake會降低甘油含量[50]。但相關倍性研究主要集中在Saccharomyces中:由于發生性狀分離,同一株二倍體親本所獲取的單倍體后代表現不同的甘油產量[3,17,29],通過篩選高產甘油的單倍體菌株,可進一步雜交形成高產甘油的二倍體[3,44]。S. uvarumS. cerevisiae雜交獲得的異源三倍體H14A7高產甘油[47]。倍性增加造成甘油產量增加可能是因為在融合過程中,引發了GPD1GPD2的過表達,從而使甘油含量增加。

                酵母菌硫代謝的中間產物之一為具有臭雞蛋氣味的H2S,屬于葡萄酒的不良風味物質之一[26]。劉美玲等[29]4株高產H2S的野生二倍體S. cerevisiaeNX11315、LFE1225、LFN524LFP525)出發制備出6株低產H2S、5株中產H2S4株高產H2S的單倍體菌株,推測與H2S產量相關的基因為隱性基因;而江璐[3]發現,低產H2S的二倍體S. cerevisiae菌株44y7的單倍體后代出現了高產、低產和不產H2S的菌株,可能是等位基因分離導致性狀分離,使高產H2S的基因性狀得以表達。在本課題組研究中,WANG[26]研究發現,雜合二倍體菌株GM1LFN524高產H2S單倍體和LFP525低產H2S單倍體雜交而成)和純合二倍體菌株UCD932(所產生單倍體皆不產H2S)都不產H2S,但二株菌的硫代謝相關基因表達情況完全不相同,說明了菌株遺傳背景和多基因參與對H2S代謝的影響。

                酯類物質與葡萄酒的香氣特征密切相關。江璐[3]篩選獲得兩株高產酯類的S. cerevisiae單倍體(174y1-3112y4-45),其中乙酸乙酯的產量*,李麗等[17]從野生二倍體S. cerevisiae中篩選獲得兩株高產乙酯的單倍體菌株(31y3-29174y-26),其中乙酸苯乙酯的產量*,賦予發酵液玫瑰花香。AGARBATI[51]研究發現,經單倍體融合后的二倍體菌株與親本二倍體菌株相比,其乙酸異戊酯產量增加,而乙酸乙酯產量卻減少,WYK[16]的結果與之相似,發現融合后的二倍體菌株增加了乙酸酯的產量。相關研究表明,Schizosaccharomyces、Candida pulcherrima(美極假絲酵母)、Hanseniaspora guilliermondii(季也蒙有孢漢遜酵母)、Pichia anomala(異常畢赤酵母)、P. fermentans、P. membranifaciens、T. debrueckii等都能提高葡萄酒中的酯類含量(乙酸己酯、乙酸乙酯、乙酸異戊酯和2-苯乙酸乙酯等)[41,52-53],但目前尚無這些菌種的倍性研究報道。

                *醇與葡萄酒的香氣特征直接相關,還可進一步通過酯化反應影響*醇酯的含量,通過氧化反應影響醛類(氧化味)的形成。相關研究一方面通過制備單倍體從中篩選出低產或高產*醇的菌株:江璐[3]篩選獲得兩株高產*醇的單倍體菌株33y7-4312y4-4y,其中異戊醇的產量*;李麗等[17]從野生二倍體S. cerevisiae中獲得一系列性狀分離的單倍體,其中9株單倍體的*醇產量比二倍體親本菌株低近60%,單倍體菌株的**醇產量為135.2mg/L。另一方面,通過單倍體融合為二倍體改變*醇的含量,AGARBATI[51]通過單倍體融合為二倍體使異丁醇、戊醇及異戊醇產量降低。雖然Lodderomyces elongisporus(長孢洛德酵母)高產異戊醇和2-苯乙醇[54],Saccharomycodes(類酵母屬)、Schizosaccharomyces(裂殖酵母屬)、M. pulcherrima、I. orientalis、H. uvarumH.vineae可影響*醇的產量[52,55],但目前尚無這些菌種的倍性研究報道。

                多糖可影響葡萄酒的“黏度”,使酒體具備豐滿的風格。GONZALEZ[10]發現缺失GAS1GPI7的單倍體S. cerevisiae高產甘露糖蛋白和多糖,其釋放量分別是沒有基因缺失的對照單倍體S. cerevisiae菌株的79倍,進一步以基因缺失的單倍體菌株為親本進行雜交得到雜合和純合二倍體菌株,純合二倍體菌株與其親本單倍體菌株非常相似,高產甘露糖蛋白和多糖,而雜合二倍體菌株甘露糖蛋白的產量均低于沒有基因缺失的對照單倍體菌株。研究表明,Hanseniaspora osmophila、P. fermentans、S. ludwigii、Zygosaccharomyces bailii(拜耳接合酵母)、L. thermotolerans、M. pulcherrimaS. ludwigii可增加葡萄酒中多糖的濃度[56],但尚缺乏相關倍性研究。

                Candida、Kloeckera、Pichia、Metschnikowia、Sporidibolus、Aureobasidium、HanseniasporaIssatchenkia具有較高的糖苷酶活性,可通過釋放糖苷結合的風味化合物提升葡萄酒的香味,如β-葡萄糖苷酶可提高葡萄酒中萜烯醇的濃度[57]。Debaryomyces pseudopolymorphus、Debaryomyces vanriji、P. fermentans、C. stella、C. sake、H. vineae、M. pulcherrimaS. bacillaris與葡萄酒中萜烯醇(香茅醇、香葉醇及橙花醇)的產量有關[52]。雖然較少S. cerevisiae菌株具備前述non-Saccharomyces菌種高產糖苷酶的特性,但研究發現,其單倍體表現出高于二倍體菌株的芳樟醇產量,而具有復雜基因背景的S. cerevisiae T73-4非整倍體菌株(近二倍體)展現了三倍于傳統實驗室菌株(包含單倍體和二倍體)的芳樟醇產量,說明具有復雜基因背景的菌株可能更適合產生異源單萜[58]。

                綜上所述,目前大部分研究關注了倍性差異對風味物質的影響,但未展開單倍體相關基因分析,因此尚未形成相關風味物質產量受倍性影響的分子機制,未來的研究可以目前研究較多的乙醇和甘油為例,拓展倍性差異影響風味物質的分子機制,為釀造不同風味的葡萄酒提供理論依據。

                2葡萄酒相關酵母倍性對葡萄酒風味物質的影響

                Tab.2 Effect of ploidy of wine-related yeast on flavoring substances in wine

                對葡萄酒風味的影響

                種名

                倍性研究

                參考文獻

                降低乙醇

                S. cerevisiae

                敲除單倍體菌株中的TSA1基因

                [46]

                單倍體與二倍體的比較

                [33]

                單倍體菌株中插入PDC2基因,再進一步融合為二倍體

                [45]

                單倍體融合為二倍體菌株

                [44]

                S. uvarum

                種間雜交(S. uvarum×S. cerevisiae)形成三倍體

                [47]

                增加甘油

                S. cerevisiae

                單倍體篩選

                [3,17,29]

                單倍體融合為二倍體菌株

                [44]

                S. uvarum

                種間雜交(S. uvarum×S. cerevisiae)形成三倍體

                [47]

                降低H2S

                S. cerevisiae

                單倍體篩選

                [3,17,29]

                單倍體菌中插入MET2基因

                [59]

                單倍體與二倍體比較

                [33]

                單倍體融合為二倍體菌株

                [26,51]

                增加酯類

                S. cerevisiae

                篩選單倍體

                [3,17,29]

                單倍體融合為二倍體菌株

                [16,51]

                降低*醇

                S. cerevisiae

                篩選單倍體

                [3,17,29]

                單倍體融合為二倍體菌株

                [51]

                增加*醇

                S. cerevisiae

                篩選單倍體

                [3,17,29]

                增加萜烯類

                S. cerevisiae

                單倍體融合為二倍體菌株

                [58]

                增加甘露糖蛋白和多糖

                S. cerevisiae

                敲除單倍體菌株中的GAS1GPI7基因缺失的單倍體,再融合形成二倍體

                [10]

                降低乙酸

                S. cerevisiae

                單倍體融合為二倍體菌株

                [16]

                降低乙醛

                S. cerevisiae

                敲除單倍體菌株中的TSA1基因

                [26,46]

                增加乙醛

                S. cerevisiae

                單倍體融合為二倍體菌株

                [51]

                 

                5 結語

                葡萄酒相關酵母與葡萄酒的風味特征形成息息相關,而酵母倍性研究可以促進有益風味和不良風味代謝途徑的剖析,為具有穩定有益性狀的二倍體菌株篩選和培育提供研究方法。近年來,葡萄酒相關酵母倍性研究取得了一些進展,主要集中在Saccharomyces屬中的S.cerevisiae,相對葡萄酒相關酵母而言,研究菌種相當局限。

                第一,目前與葡萄酒風味形成相關的酵母倍性研究多以S. cerevisiae為主,其他菌種較少,可能與其他菌種的倍性基礎研究較少、生孢和單倍體制備條件明顯不同于S. cerevisiae、單倍體存活率低或留存時間短等困難有關。此外,在本課題前期研究中發現,Hanseniaspora屬在生孢上非常困難,且不容易判斷是否產孢;Schizosaccharomyces雖然生孢非常容易,但由于生長周期的特異性,導致單倍體間很容易融合為二倍體,分離出單倍體在技術上存在一定的困難。在今后的研究中,需結合S. cerevisiae的基礎研究成果,開發適用于non-Saccharomyces菌種的基礎倍性研究技術,為其進一步的應用提供理論基礎。

                第二,就S. cerevisiae的倍性研究而言,關于乙醇、H2S和甘油的相關報道較多,而酯類和萜烯類的研究較少,可能與S. cerevisiae的釀造特性有關。亟待在未來的研究中更多關注S. cerevisiaeβ-葡萄糖苷酶、酯類和萜烯類等風味形成、Hanseniasporaβ-葡萄糖苷酶進而釋放萜烯類物質、S. japonicus在甘油、蘋果酸和甘露糖蛋白/多糖代謝、Pichia在酯類和多種芳香化合物(如萜烯、C13-降異戊二烯和C6化合物)代謝等方面的倍性研究,從而為葡萄酒的特色化和多樣化生產提供菌種基礎。

                第三,在S. cerevisiae的倍性中,對于倍性分子機制的研究甚少。近幾年的研究集中于倍性差異會導致酵母的耐受性和發酵性能不同,但是沒有從分子機制的層面對這一差異作出分析解釋。

                總之,目前對葡萄酒相關酵母倍性研究的報道較多,但將倍性運用到葡萄酒發酵中的研究甚少,特別是倍性隨著發酵進程的變化情況,以及在發酵中如何利用不同倍性酵母等,有待進一步關注。non-Saccharomyces屬的基礎倍性研究將促進其在葡萄酒發酵中的應用,為增強葡萄酒的風味復雜性提供菌株支持。

                 

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